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鎳Ni柱L00666進行蛋白純化的原理與使用方法

點擊次數(shù):930更新時間:2022-11-02
  鎳Ni柱L00666是大家在蛋白純化中,應(yīng)用較多的一種純化柱料,屬于固定化金屬離子親和色譜中的一種,1975年由Porath等發(fā)明,其間不斷完善發(fā)展至今。
  
  過渡金屬通過與電子供體配基上,能與金屬離子相互作用的羧基或氨基的電負(fù)性元素(O,N),形成較穩(wěn)定的金屬螯合物。在IMAC中,一個Ni2+有六個配位位點,被含有3,4或5個電子供體基團(配位位點)的螯合物固定在吸附劑上,而剩下未被占據(jù)的位點暴露于溶液中,能與組氨酸,半胱氨酸,和色氨酸的側(cè)鏈或組氨酸標(biāo)簽的蛋白特異性結(jié)合。
  
  IMAC的螯合配基,常見有IDA(亞氨基二乙酸),NTA(次氮基三乙酸),TED(羧甲基乙二胺等,分別擁有3,4,5個配位位點與Ni2+結(jié)合,而空余的能與組氨酸標(biāo)簽結(jié)合的位點還剩3,2,1個。
  
  所以IDA與His標(biāo)簽蛋白結(jié)合力相對較強,特異性較弱,而TED則相反。我們在實際應(yīng)用中通常選擇載量與特異性適中的NTA類型。
  
  鎳Ni柱L00666的洗脫通常采用競爭洗脫,先用低濃度的咪唑?qū)㈦s蛋白和結(jié)合不牢的蛋白洗去,再用合適的濃度將目的蛋白洗脫。洗脫的先后順序與蛋白的結(jié)合能力相關(guān)。
  
  另外,在鎳Ni柱L00666的使用中,應(yīng)當(dāng)避免緩沖液中存在還原劑和螯合劑,以免Ni2+被還原而脫落。如果柱料使用太久積累了很多雜蛋白,可用EDTA將Ni2+螯合下來,再用NaOH清洗柱料后,重新螯合Ni離子,即可完成再生。平時不用時,應(yīng)保存在20%乙醇中防止長菌。
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